Καινοτόμο εργαλείο βιοπαρακολούθησης ποταμών

Η βιοπαρακολούθηση των ποταμών, αν και μία καλά καθιερωμένη και τυποποιημένη προσέγγιση καθορισμού της ποιότητας των υδάτων συνοδεύεται από κάποιες αναγνωρισμένες δυσκολίες. Οι κυριότερες είναι οι χρονοβόρες και δαπανηρές διαδικασίες επεξεργασίας και ανάλυσης των δεδομένων, καθώς και η απαίτηση εξειδικευμένου εξοπλισμού και τεχνογνωσίας για την ταξινομική ταυτοποίηση των ειδών. Με την πάροδο των χρόνων ωστόσο, αναπτύχθηκαν νέες μέθοδοι οι οποίες συνέβαλαν στη βελτίωση του χρόνου και του κόστους που απαιτεί η διαδικασία της βιοπαρακολούθησης των ποταμών. Μια τέτοια μέθοδος είναι η μεταραβδοκωδικοποίηση DNA διατόμων (Diatom DNA metabarcoding), μέσω της οποίας η αναγνώριση των διαφορετικών ειδών διατόμων από δείγμα νερού γίνεται βάσει της γενετικής μεταβλητότητας του δείγματος, χρησιμοποιώντας ραβδοκώδικες (barcodes).

Τα διάτομα και η χρήση τους ως βιοδείκτες

Μπορεί να μην έχετε ακούσει ποτέ για αυτά, μπορεί να μην τα έχετε δει (είναι αδύνατον με γυμνό μάτι!), αλλά τα διάτομα είναι από τους σημαντικότερους οργανισμούς με τους οποίους μοιραζόμαστε τον πλανήτη! Η ευρεία εξάπλωση τους στα υδάτινα οικοσυστήματα, όπως επίσης και η μεγάλη ευαισθησία τους στις μεταβολές των περιβαλλοντικών συνθηκών, τα καθιστά ως ένα χρήσιμο εργαλείο βιοπαρακολούθησης και χαρακτηρισμού της ποιότητας των υδάτων (Διαβάστε περισσότερα).

Η μεταραβδοκωδικοποίηση περιλαμβάνει τη συλλογή δείγματος νερού από ένα ποταμό και στη συνέχεια την εξαγωγή του γονιδιωματικού DNA. Έπειτα, εφαρμόζεται η μέθοδος της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR) με στόχο την ενίσχυση του γονιδιοραβδοκώδικα ενδιαφέροντος (π.χ. το γονίδιο «rbcL» που χρησιμοποιείται συχνά ως δείκτης DNA για τα διάτομα). Ακολουθεί αλληλούχιση DNA σε ειδικά όργανα που μπορούν να διαχωρίσουν μεμονωμένα μόρια του DNA. Στο τελικό στάδιο, οι αλληλουχίες που απομονώνονται, με τη βοήθεια της βιοπληροφορικής αντιπαραβάλλονται σε βάσεις δεδομένων ώστε να γίνει αντιστοίχιση της  κάθε αλληλουχίας DNA σε ένα είδος.

Η πρόσφατη ραγδαία ανάπτυξη των τεχνικών μεταραβδοκωδικοποίησης DNA αποτελεί ορόσημο στη βιοπαρακολούθηση. Με την τεχνική αυτή, αντί η ταυτοποίηση των ειδών να βασίζεται σε μορφολογικά χαρακτηριστικά και τη χρήση μικροσκοπίου, επιλέογονται γονιδιακοί δείκτες για τον εντοπισμό ταξινομικών αλληλουχιών στο DNA του υπό μελέτη οργανισμού. Με τον τρόπο αυτό επιτρέπεται η ταυτόχρονη αναγνώριση πολλών ταξινομικών ομάδων / ειδών από πολλά περιβαλλοντικά δείγματα. Ως εκ τούτου, καθίσταται χρονικά και οικονομικά αποδοτικότερη από τις παραδοσιακές μεθόδους. 

Στα πλαίσια του ερευνητικού έργου Wat-Dimon, γίνεται προσπάθεια να αναπτυχθούν αυτοματοποιημένα μοριακά εργαλεία για την ταυτοποίηση και την ποσοτικοποίηση διατόμων από δείγματα ποταμών αλλά και να αναπτυχθούν συμπληρωματικά βιοπληροφορικά εργαλεία για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της μεταραβδοκωδικοποίησης. Προς το σκοπό αυτό έχουν ολοκληρωθεί δειγματοληψίες σε επιλεγμένα ποτάμια της Κύπρου, της Ισπανίας και της Πορτογαλίας, καλύπτοντας διαφορετικούς τύπους ροής και διαφορετικές εντάσεις πιέσεων σε τέσσερις βιογεωγραφικές περιοχές (Αλπική, Ατλαντική, Μακαρονησιακή και Μεσογειακή). Με την προσέγγιση αυτή, καλύπτεται το μεγαλύτερο μέρος των ταξινομικών ομάδων διατόμων που χρησιμοποιούνται στη βιοπαρακολούθηση των ποταμών.

Εικόνα 1: Περιοχές στις οποίες έχουν γίνει δειγματοληψίες για ανάπτυξη μοριακών εργαλείων βιοπαρακολούθησης με βάση τα διάτομα.

Οι ταξινομικές ομάδες διατόμων που εντοπίζονται με την μέθοδο της μεταραβδοκωδικοποίησης DNA συγκρίνονται σε Βάσεις Δεδομένων Νουκλεοτιδικών Αλληλουχιών, όπως είναι οι Diat. Barcode, BOLD και GenBank.   Ωστόσο, μετά από διερευνητική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, προέκυψε ότι οι προαναφερθείσες βάσεις δεδομένων δεν περιλαμβάνουν πληροφορίες για τους ραβδοκώδικες (barcodes) ενός ποσοστού 30-50% απο το σύνολο των διατόμων που ταυτοποιήθηκαν μορφολογικά στις περιοχές όπου έγιναν οι δειγματοληψίες, γεγονός που καθιστά αδύνατη την ταυτοποίηση τους μέσω της  μεταραβδοκωδικοποίησης DNA. Η ενίσχυση αυτών των βάσεων δεδομένων επομένως με πληροφορίες για τα είδη διατόμων που επικρατούν στις περιοχές που μελετώνται στα πλαίσια του Ευρωπαϊκού προγράμματος Wat-Dimon κρίνεται απαραίτητη, καθώς παρόλο που περιέχουν εκτενή αριθμό πληροφοριών για είδη διατόμων στις βόρειες περιοχές, εμφανίζουν σημαντική έλλειψη δεδομένων για είδη διατόμων σε θερμές περιοχές όπως είναι η Μεσόγειος και η Μακαρονησία.

Σχήμα 1: Ενδεικτικά ποσοστά έλλειψης ραβδοκώδικα από τις βάσεις δεδομένων, για είδη διατόμων που εντοπίζονται στο υφιστάμενο πρόγραμμα βιοπαρακολούθησης και αναγνωρίζονται μορφολογικά.

Για την Κύπρο έχει ήδη εντοπιστεί ένας μεγάλος αριθμός ειδών διατόμων για τα οποία δεν υπάρχουν πληροφορίες για τους ραβδοκώδικους τους στις βάσεις δεδομένων και έχουν γίνει παράλληλα στοχευμένες δειγματοληψίες για απομόνωσή τους και συμπλήρωση των βάσεων. Επιπρόσθετα, έχουν ληφθεί 52 δείγματα από θέσεις στους ποταμούς Κούρη, Λιμνάτη και Κρυό στην επαρχία Λεμεσού. Τα δείγματα έχουν αναλυθεί τόσο μορφολογικά με την παραδοσιακή μέθοδο της μικροσκοπίας, όσο και μοριακά με τη μεταραβδοκωδικοποίηση DNA και θα γίνει σύγκριση των αποτελεσμάτων στην προσπάθεια βελτιστοποίησης της δεύτερης. 

Τα μέχρι τώρα αποτελέσματα υποστηρίζουν τις ενδείξεις από τη διεθνή βιβλιογραφία, ότι η μεταραβδοκωδικοποίηση DNA διατόμων αποτελεί μία καινοτόμο τεχνική, η οποία μπορεί να υποστηρίξει και να συμπληρώσει τις παραδοσιακές μεθόδους βιοπαρακολούθησης των υδάτινων σωμάτων και δυνητικά μπορεί να παρέχει αξιόπιστα και υψηλής ποιότητας τυποποιημένα δεδομένα με αποδοτικό τρόπο, τόσο από άποψη κόστους, όσο και χρόνου. Παρόλα αυτά, για να χρησιμοποιηθεί η τεχνική της μεταραβδοκωδικοποίησης DNA διατόμων ως εργαλείο ρουτίνας στη βιοπαρακολούθηση υδάτινων σωμάτων, απαιτείται η τυποποίηση της μεθόδου.

Βιβλιογραφία:
Lobo, E. A., Heinrich, C. G., Schuch, M., Wetzel, C. E., & Ector, L. (2016). Diatoms as bioindicators in rivers. In River Algae (pp. 245-271). Springer, Cham.

Lopez, P. J., Descles, J., Allen, A. E., & Bowler, C. (2005). Prospects in diatom research. Current opinion in Biotechnology, 16(2), 180-186.

Rivera, S. F., Vasselon, V., Bouchez, A., & Rimet, F. (2020). Diatom metabarcoding applied to large scale monitoring networks: Optimization of bioinformatics strategies using Mothur software. Ecological indicators, 109, 105775.

Sharma, N. K., & Rai, A. K. (2011). Biodiversity and biogeography of microalgae: progress and pitfalls. Environmental Reviews, 19(NA), 1-15.

WAT-DIMON- Novel DNA-based test for the identification of benthic diatoms of European Freshwater Waterbodies (EUROSTARS/0519/0005) [Internet]. Iaco.com.cy [cited 2021 Dec 5]. Available from: http://www.iaco.com.cy/wat-dimon-novel-dna-based-test-for-the-identification-of-benthic-diatoms-of-european-freshwater-waterbodies-eurostars-0519-0005/

New collaboration in the framework of the Eurostars project E-Wat-Dimon [Internet]. Oikotoxicologia.org. 2020 [cited 2021 Dec 5]. Available from: https://oikotoxicologia.org/eurostars-project-e-wat-dimon/

Το έργο Wat-Dimon – Developing DNA-based test for the identification of benthic diatoms of European freshwater bodies, χρηματοδοτείται από το Ίδρυμα Έρευνας και Καινοτομίας -στα πλαίσια του προγράμματος Eurostars- τα Ευρωπαϊκά Ταμεία Περιφερειακής Ανάπτυξης και τα Διαρθρωτικά Ταμεία. Υλοποιείται με τη συμβολή των Laboratorios Tecnologicos de Levante, Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο Κύπρου και I.A.CO Environmental & Water Consultants.