Είναι αξιόπιστη η PCR για διάγνωση Covid-19;

Πολύς ντόρος γίνεται για τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της νόσου Covid-19 και ως επακόλουθο, την ανίχνευση του ιού SARS-CoV-2 που την προκαλεί. Ναι μεν η PCR αποτελεί μια από τις πιό αξιόπιστες μεθόδους ταυτοποίησης παθογόνων μικροοργανισμών, η φήμη της όμως έχει σπιλωθεί από τα περιστασιακά ψευδή αποτελέσματα που εξάγει (είτε αρνητικά είτε θετικά) και από φημολογίες και θεωρίες συνομωσίας, π.χ. «ότι ο επιστήμονας που εφηύρε τη μέθοδο PCR δήλωσε ότι δεν προορίζεται για ιατρικούς διαγνωστικούς σκοπούς». Σε αυτό το άρθρο λοιπόν, θα δούμε συνοπτικά το ιστορικό πίσω από αυτή την τεράστια εφεύρεση που ώθησε την επιστήμη να κάνει μεγάλα άλματα προόδου, θα εξηγήσουμε πολύ απλά το πως εφαρμόζεται στην περίπτωση της νόσου και τέλος θα αναλύσουμε την ακρίβεια της μεθόδου όσον αφορά την ανίχνευση του ιού SARS-CoV-2.

Πώς προέκυψε η μέθοδος PCR;

H ιστορία ξεκινάει τη δεκαετία του ’80, τότε που η μελέτη του DNA ήταν ιδιαίτερά δύσκολη έως και ακατόρθωτη με τα τεχνολογικά μέσα της εποχής. Ακόμα και η επιτυχής απομόνωση ενός τμήματος DNA που ενδιέφερε κάποιον επιστήμονα, δεν ήταν επαρκής για να γίνει μια ολοκληρωμένη έρευνα, αφού δεν μπορούσε να αναλυθεί εκτενέστερα το τμήμα αυτό του DNA λόγω του πολύ μικρού μεγέθους του. Ως εκ τούτου, η κλωνοποίηση του DNA ήταν κάτι που απασχόλησε ιδιαίτερα την επιστημονική κοινότητα την εποχή εκείνη.

Ενδεικτικά, η απόσταση μεταξύ δύο διαδοχικών ζευγών βάσεων είναι περίπου 3.4A, οπότε μια αλληλουχία των 1000 αζωτούχων βάσεων που ενδεχομένως να μας ενδιαφέρει για μελέτη, έχει μήκος συνολικά 340A. Αυτό αντιστοιχεί σε 34nm, μέγεθος κατά περίπου 3000 φορές μικρότερο από το ελάχιστο δυνατό που μπορούμε να δούμε με γυμνό μάτι, που είναι γύρω στα 10⁴nm [1].

Ο βιοχημικός Kary Mullis το 1983, ήταν ο επιστήμονας που βρήκε τον τρόπο κλωνοποίησης του μορίου DNA σε πολλά αντίγραφα και έτσι, προσπέρασε ένα τεράστιο εμπόδιο για τη μελέτη του DNA. Στο βιβλίο Dancing Naked in the Mind Field με τα απομνημονεύματα του, αναφέρει συγκεκριμένα τη φράση που είπε τότε: «Η απλή αυτή τεχνική θα κάνει όσα αντίγραφα θέλω, για όποια αλληλουχία του DNA επιλέξω και όλοι στη Γη που νοιάζονται για το DNA θα θέλουν να τη χρησιμοποιήσουν». Έτσι και έγινε λοιπόν και το 1993 αναγνωρίστηκε το έργο του, απονέμοντας του το βραβείο Νόμπελ Χημείας για την εφεύρεση της μεθόδου PCR [2].

Εικόνα 1: Ο εκκεντρικός Δρ. Kary Banks Mullis, εφευρέτης της PCR [3].

Πώς πραγματοποιείται η ταυτοποίηση του ιού;

Όπως ήδη προανάφερα, η PCR αποτελεί μια μοριακή μέθοδο που μας δίνει την δυνατότητα να δημιουργήσουμε πολλά αντίγραφα από μία αλληλουχία γενετικού κώδικα. Με άλλα λόγια, μας επιτρέπει να επιλέξουμε ένα τμήμα του κώδικα που μας ενδιαφέρει και να το πολλαπλασιάσουμε όσες φορές θέλουμε. Τα αρχικά γράμματα PCR προέρχονται από τις λέξεις Polymerase Chain Reaction. Ο όρος Polymerase υποδεικνύει την χρήση ενζύμου το οποίο διαθέτει το χαρακτηριστικό να αντιγράφει το γενετικό κώδικα και εντοπίζεται φυσιολογικά σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς (πλην των ιών), που διαθέτουν τους μηχανισμούς αυτοδιπλασιασμού του γενετικού τους κώδικα.

Ο ιός SARS-CoV-2 – όπως και όλοι οι ιοί – έχει την ιδιότητα να διεισδύει στο κύτταρο ξενιστή όπου απελευθερώνει το γενετικό του φορτίο και χρησιμοποιεί τις λειτουργίες του κυττάρου αυτού που μολύνει για να παράξει τελικά, τα αντίγραφα του (δηλ. τους απογόνους του). Στην περίπτωση της νόσου Covid-19, ο ιός προσβάλει κύτταρα που εντοπίζονται στο αναπνευστικό μας σύστημα και πιο συγκεκριμένα, τα κυψελιδικά κύτταρα και τα πηνιώδη κύτταρα του πνεύμονα [4]. Γι’ αυτό, το δείγμα για τις διάφορες διαγνωστικές εξετάσεις λαμβάνεται από το στοματοφάρυγγα, το ρινοφάρυγγα ή τις βρογχικές εκκρίσεις.

Όλοι οι οργανισμοί έχουν την τάση να δρουν προς την ολοκλήρωση του κύκλου ζωής τους και την επίτευξη του τελικού στόχου, που δεν είναι άλλος από την διαιώνιση του είδους τους. Για παράδειγμα εμείς, σαν Homo Sapiens, γεννιόμαστε και επιβιώνουμε λόγω της φροντίδας των γονιών μας (κυρίως κατά την παιδική ηλικία), μέχρι να ενηλικιωθούμε και εν τέλη να φέρουμε με τη σειρά μας απογόνους, ολοκληρώνοντας με αυτό τον τρόπο τον κύκλο ζωής μας.  Όπως εμείς λοιπόν, δρούμε με αυτό τον τρόπο, έτσι και όλοι οι άλλοι οργανισμοί πάνω στη Γη, έχουν την τάση να το κάνουν, από τους ελέφαντες και τα λιοντάρια, μέχρι και τους πιο μικροσκοπικούς οργανισμούς, τα βακτήρια και τους ιούς. Σε κάθε είδος ωστόσο, είναι σημαντικό να ξεκαθαριστεί ότι διαφέρει ο μηχανισμός αναπαραγωγής.

Όταν λαμβάνεται το δείγμα, αποστέλλεται στο εργαστήριο για τη διαγνωστική εξέταση. Η φιλοσοφία που ακολουθείται είναι ότι εξάγεται το γενετικό υλικό από τα κύτταρα σε πρώτη φάση και ακολούθως με τη βοήθεια της μεθόδου PCR πραγματοποιείται ο εντοπισμός ή όχι, του γενετικού κώδικα που προέρχεται από τον ιό. Επομένως, μετά την ολοκλήρωση της PCR, είτε θα προκύψουν πολλά αντίγραφα του συγκεκριμένου τμήματος που θα επιβεβαιώνουν την επιμόλυνση με τον ιό, είτε το δείγμα θα ειναι αρνητικό, που σημαίνει πως δεν έγινε ανίχνευση του ιού.

Το γονιδίωμα που προέρχεται από την επιμόλυνση του ιού έχει μέγεθος περίπου 30 000 kb  [5, 6] και έχει απομονωθεί από πολλά αναγνωρισμένα πανεπιστήμια και ερευνητικά κέντρα ανά τον κόσμο. Η επιβεβαίωση της ύπαρξης του ιικού γονιδιώματος, έγινε με τη διασταύρωση των αποτελεσμάτων που εξήχθησαν από τις παράλληλες έρευνες που πραγματοποιήθηκαν στα διάφορα εργαστήρια [7].

Πόσο ακριβής είναι η μέθοδος PCR στην εξαγωγή έγκυρων αποτελεσμάτων;

Εικόνα 2: Αναπαράσταση της διαδικασίας πολλαπλασιασμού DNA μέσω της μεθόδου PCR [8].

Είναι γεγονός ότι η πολυπλοκότητα αλλά και η ευαισθησία των μοριακών μεθόδων τις κάνουν ιδιαίτερα δύσκολες κατά το χειρισμό τους. Σε αυτές τις δυσκολίες έρχεται να προστεθεί και ο χειρισμός της μεθόδου από μη αρτια καταρτισμένα άτομα. Λόγω όμως των αυξημένων αναγκών εξαιτίας της παρούσας κατάστασης, κλήθηκαν να αναλάβουν ακόμα και άτομα χωρίς προηγούμενη πείρα, ενώ σε αυτό ήρθε να συμβάλει και ο μεγάλος όγκος δειγμάτων σε συνδυασμό με το το αυξημένο φόρτο εργασίας. Επομένως είναι κατανοητό αλλά και αναπόφευκτο να προκύπτουν ορισμένα σφάλματα κατά την εκτέλεση των αναλύσεων που οδηγούν στην εξαγωγή ψευδών αποτελεσμάτων. Μικρά συνήθη λάθη π.χ. στις συγκεντρώσεις και ποσότητες των διαφόρων αντιδραστηρίων ή στην εκτέλεση των μεθόδων, μπορούν να αλλοιώσουν το τελικό αποτέλεσμα και να μην εντοπίσουν την ύπαρξη του ιού (ψευδώς αρνητικά). Από την άλλη, σφάλματα που οφείλονται σε παράγοντες επιμόλυνσης π.χ ο μη κατάλληλα απολυμασμένος χώρος εργασίας, ενδέχεται να οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα [9].

Εκτός όμως από το ρόλο του ανθρώπινου παράγοντα, προκύπτει και το ζήτημα της ακρίβειας της μεθόδου για τη διάγνωση της συγκεκριμένης νόσου. Βάση μελέτης της L. Kucirka και των συνεργατών της, τέσσερις ημέρες πριν την εμφάνιση των συμπτωμάτων η πιθανότητα ψευδούς αρνητικού αποτελέσματος ξεκινά από 100% και καταλήγει στο 67% την 4η ημέρα σε σειρά. Από την 5η ημέρα που τα συμπτώματα είναι πλέον εμφανή, η πιθανότητα ψευδούς αρνητικού φτάνει στο 38% και καταλήγει στο 20% την 8η ημέρα. Μετέπειτα ακολουθεί μια αυξητική πορεία από 21% την 9η ημέρα στο 66% την 21η. Ως εκ τούτου, η ιδανική χρονική στιγμή για να κάνει κάποιος έλεγχο με τη μέθοδο PCR – αν έχει μολυνθεί με τον ιό –  είναι τρεις ημέρες μετά την εμφάνιση συμπτωμάτων (8η ημέρα μόλυνσης), για να αποφύγει στο μέγιστο δυνατό την πιθανότητα ψευδούς αρνητικού αποτελέσματος [10]. Αξιοσημείωτο συνεπώς το γεγονός ότι ειδικά τις πρώτες τέσσερις ημέρες μόλυνσης, η ακρίβεια της μεθόδου κρίνεται μηδαμινή.

Πηγές

1. Bosco J. What is the Smallest Thing You Can See? [Internet]. Wonderopolis. 2014 [cited 2021 Apr 10]. p. 2. Available from: https://www.wonderopolis.org/wonder/what-is-the-smallest-thing-you-can-see
2. The eccentric scientist behind the ‘gold standard’ COVID-19 test [Internet]. [cited 2021 May 23]. Available from: https://www.nationalgeographic.com/science/article/the-eccentric-scientist-behind-the-gold-standard-covid-19-pcr-test
3. Dr. Kary Banks Mullis [Internet]. [cited 2021 May 23]. Available from: http://www.karymullis.com/
4. Coronavirus: How does COVID-19 attack the human body? | UK News | Sky News [Internet]. [cited 2021 Jun 16]. Available from: https://news.sky.com/story/coronavirus-how-does-covid-19-attack-the-human-body-11947643
5. Weiss SR, Navas-Martin S. Coronavirus pathogenesis and the emerging pathogen severe acute respiratory syndrome coronavirus. Microbiol Mol Biol Rev. 2005;69(4):635–64
6. Su S, Wong G, Shi W, Liu J, Lai ACK, Zhou J, et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends Microbiol. 2016;24(6):490–502.
7. Gómez-Carballa A, Bello X, Pardo-Seco J, Martinón-Torres F, Salas A. Mapping genome variation of SARS-CoV-2 worldwide highlights the impact of COVID-19 super-spreaders. Genome Res. 2020;30(10):1434–48.
8. Genetic Analysis  – GMO Testing [Internet]. [cited 2021 Apr 10]. Available from: https://gmotesting.com/testing-options/genetic-analysis/
9. Robert H. Shmerling M. Which test is best for COVID-19? – Harvard Health Blog – Harvard Health Publishing [Internet]. [cited 2021 Apr 10]. Available from: https://www.health.harvard.edu/blog/which-test-is-best-for-covid-19-2020081020734
10. Kucirka LM, Lauer SA, Laeyendecker O, Boon D, Lessler J. Variation in False-Negative Rate of Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction-Based SARS-CoV-2 Tests by Time Since Exposure. Vol. 173, Annals of internal medicine. NLM (Medline); 2020. p. 262–7.